miRNA-34a负性调控转录因子Yin Yang 1（YY1）对食管鳞癌TE-1细胞功能的影响及机制研究

【摘要】第一部分miR-34a对食管鳞癌细胞系TE-1生物学功能的影响目的：研究人miRNA-34a对食管鳞癌细胞系TE-1生物学功能的影响。方法：通过化学合成的成熟型人miR-34a模拟体及抑制剂，瞬时转染至TE-1细胞中，实时荧光定量PCR检测进行鉴定，检测miR-34a的表达量。采用MTT法和克隆形成实验检测miR-34a对TE-1细胞增殖的影响；流式细胞仪检测对TE-1细胞凋亡的影响；Transwell小室检测对TE-1细胞侵袭功能的影响；细胞划痕实验检测对TE-1细胞迁移功能的影响；Westernblot检测凋亡及侵袭相关蛋白的表达。结果：实时荧光定量PCR显示miR-34a在TE-1细胞中的表达量明显上调或下调；通过MTT法和癌灶形成实验，发现miR-34amimic抑制TE-1细胞的生长和克隆团的形成；流式细胞术检测发现miR-34amimic促进TE-1细胞的凋亡；Westernblot结果显示，miR-34a抑制Bcl-2、PARP-1的表达，增加Bax蛋白表达水平。通过划痕和Transwell侵袭实验，我们观察到转染人源miR-34amimic的细胞组侵袭迁移能力下降。相反，转染miR-34ainhibitor后，则促进细胞的生长和克隆团的形成，抑制细胞的凋亡，并且可以增加细胞的侵袭迁移能力。Westernblot结果显示，miR-34a负性调控迁移相关基因MMP-2和MMP-9的蛋白表达。结论：化学合成的成熟型miR-34a可以转染入TE-1细胞，能显著提高转染细胞中miR-34a的表达量。转染miR-34a后抑制TE-1细胞的生长，促进其凋亡，并且抑制TE-1细胞的侵袭迁移能力。第二部分miR-34a通过下调转录因子YY1的表达影响TE-1细胞的侵袭迁移能力目的：研究转录因子YY1对TE-1细胞侵袭、迁移作用的影响。方法：建立双荧光素酶报告基因，验证YY1是miR-34a的靶基因之一，Westernblot进一步验证二者的相关性；Transwell小室检测对TE-1细胞侵袭功能的影响；细胞划痕实验检测对TE-1细胞迁移功能的影响；Westernblot检测侵袭相关蛋白的表达。结果：通过荧光素酶报告基因结果显示miR-34a可明显抑制包含YY13’UTR片段载体的荧光素酶表达，确定了miR-34a与YY1二者之间的关系。Westernblot进一步验证miR-34a抑制YY1的表达。这些结果表明，YY1可能是miR-34a的靶基因之一。转染YY1过表达载体的细胞组侵袭能力高于对照组细胞，沉默YY1的表达则抑制细胞侵袭；细胞共转染miR-34amimic和shRNA-YY1，Westernblot和Transwell实验发现shRNA-YY1能逆转miR-34a对TE-1细胞的侵袭迁移抑制作用。结论：YY1是miR-34a的靶基因，miR-34a在食管鳞癌中具有侵袭迁移抑制作用，可能与其靶基因YY1有关，表达下调的YY1能逆转miR-34a对TE-1细胞的侵袭迁移作用。第三部分X射线对miR-34a和转录因子YY1表达的影响目的：研究电离辐射后TE-1细胞中miR-34a及转录因子YY1的表达方法：实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达变化；Westernblot检测转录因子YY1的蛋白表达水平。结果：在0、2、4、6、8GyX射线照射，24、48和72小时后miR-34a的表达量逐渐下降；随着时间和剂量的增加，YY1的蛋白表达量也逐渐增加。结论：YY1是miR-34a的靶基因，X射线照射后，随着时间和照射剂量的增加，YY1表达量逐渐增加，而miR-34a表达量逐渐减少。
【作者】葛欣；
【导师】曹建平；张舒羽；
【作者基本信息】苏州大学，放射医学，2014，硕士
【关键词】miR-34a；YinYang1(YY1)；食管鳞癌；侵袭；生长；

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